Automatisierung der iPSC-Erzeugung, um eine autologe Photorezeptorzellersatztherapie zu ermöglichen

Journal of Translational Medicine Band 21, Artikelnummer: 161 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die angeborene Netzhautdegeneration ist eine der Hauptursachen für unheilbaren Sehverlust in der entwickelten Welt. Während ein autologer iPSC-vermittelter Photorezeptorzellersatz theoretisch möglich ist, hat der Mangel an kommerziell verfügbaren Technologien, die eine parallele Produktion patientenspezifischer Therapeutika mit hohem Durchsatz ermöglichen sollen, die klinische Umsetzung behindert.

In dieser Studie beschreiben wir den Einsatz der Präzisionsroboter-Zellkulturplattform Cell X, um die parallele Produktion patientenspezifischer iPSCs in klinischer Qualität zu ermöglichen. Das Cell X ist in einem geschlossenen aseptischen Isolator der ISO-Klasse 5 cGMP (Biospherix

Patienten-iPSCs, die mit der Cell Wie mittels Immunfärbung und konfokaler Mikroskopie festgestellt wurde, führten die mit der Cell Darüber hinaus ergab die Analyse der Einzelzell-RNA-Sequenzierung 120 Tage nach der Differenzierung, dass die mit der Cell-X-Plattform erzeugten Zellen mit denen vergleichbar waren, die unter manuellen Bedingungen in einem separaten Labor erzeugt wurden.

Wir haben erfolgreich eine Roboter-iPSC-Generierungsplattform und Standardarbeitsanweisungen für die Produktion hochwertiger Photorezeptor-Vorläuferzellen entwickelt, die mit den aktuellen guten Herstellungspraktiken kompatibel sind. Dieses System ermöglicht die Produktion von iPSCs in klinischer Qualität für den autologen Netzhautzellersatz.

Seit der ersten erfolgreichen Nierentransplantation zwischen eineiigen Zwillingen im Jahr 1954 [1] hat sich das Gebiet der regenerativen Medizin floriert. Die Transplantation von HLA-passenden festen Organen ist mittlerweile an der Tagesordnung und rettet jedes Jahr Tausende von Leben [2, 3]. Der Erfolg der Transplantation solider Organe ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass das Gewebe über einen längeren Zeitraum nach der Ernte lebensfähig bleibt und dass es durch eine Kombination aus Mikrochirurgie und peripherem Nervensystem (PNS) möglich ist, funktionelle Verbindungen mit dem Wirt wiederherzustellen. Reinnervation. Im Gegensatz zu peripheren Organen bieten reife Gewebe des Zentralnervensystems (ZNS) nicht die gleichen Vorteile. Insbesondere erleiden ZNS-Gewebe innerhalb von Minuten nach dem Verlust der Durchblutung irreversible Schäden. Darüber hinaus ist die Regenerationsfähigkeit reifer ZNS-Neuronen aufgrund sowohl umweltbedingter als auch zelleigener Eigenschaften begrenzt. Nach einer subretinalen Transplantation in retinale degenerative Mäuse gelingt es beispielsweise intakten Schichten reifer Photorezeptorzellen nicht, die Axone zu verlängern oder synaptische Verbindungen mit den Interneuronen der Netzhaut des Wirts herzustellen [4]. Im Gegensatz dazu können sich entwickelnde retinale Vorläuferzellen nach der Transplantation problemlos in die dystrophische Wirtsretina integrieren [5]. Aus diesem Grund haben wir und andere unsere Aufmerksamkeit auf die Entwicklung stammzellbasierter Photorezeptorzellersatzstrategien für die Behandlung von Patienten mit degenerativer Blindheit der Netzhaut gerichtet [6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23].

Während sich retinale Vorläuferzellen und postmitotische Photorezeptor-Vorläuferzellen in einem geeigneten Entwicklungsstadium für eine Netzhauttransplantation befinden [5, 24, 25, 26, 27], können diese Zellen nur aus der Netzhaut fetaler Spender im Spätstadium gewonnen werden, was sie sowohl ethisch ungünstig als auch schwierig macht in ausreichender Zahl zu erhalten, um klinisch lebensfähig zu sein. Anstatt retinale Vorläuferzellen aus einem sich entwickelnden Fötus zu isolieren, hat das Fachgebiet einen Großteil seiner Aufmerksamkeit auf die Entwicklung von Protokollen gerichtet, die die Differenzierung pluripotenter Stammzellen in die gewünschten Zelltypen steuern sollen [28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44].

Sowohl embryonale (ESCs) als auch induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) wurden verwendet, um transplantierbare retinale Vorläufer- und Photorezeptor-Vorläuferzellen zu erzeugen [8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 20, 21, 44]. Während ESCs nicht frei von ethischen Debatten sind, haben die National Institutes of Health ein Register etablierter ES-Zelllinien geführt, die für die Verwendung in NIH-finanzierten Arbeiten akzeptabel sind [45]. Diese Linien wurden vollständig charakterisiert und stehen für den Vertrieb bereit. Der Vorteil der Verwendung einer einzigen ESC-Linie für den klinischen Zellersatz besteht darin, dass mithilfe leicht verfügbarer Herstellungsansätze im großen Maßstab eine validierte Masterzellbank transplantierbarer Nachkommen erstellt werden kann. Ein mit diesem Ansatz verbundener Nachteil besteht darin, dass Spender und Empfänger genetisch nicht übereinstimmen (dh allogen sind). Um die Langlebigkeit des Allotransplantats sicherzustellen, ist wahrscheinlich eine lebenslange Immunsuppression erforderlich.

Im Gegensatz zu ES-Zellen können iPSCs vom Patienten in Bedarf (d. h. autolog) erzeugt werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Immunabstoßung und die Notwendigkeit einer lebenslangen Immunsuppression nach einer Transplantation erheblich verringert wird (46, 47). Leider sind aktuelle Fertigungsstrategien, die in erster Linie auf die Herstellung eines einzelnen Produkts in großem Maßstab ausgelegt sind, für die Produktion autologer Zelltherapien nicht gut geeignet. Der Ersatz autologer Photorezeptorzellen erfordert die parallele Produktion von patienteneigenen iPSCs und die Gewinnung retinaler Vorläuferzellen von Dutzenden von Individuen. Während dies durch einfaches Hinzufügen von technischem Personal erreicht werden könnte, von dem jeder für die Erzeugung einer kleinen Anzahl von Zelllinien gemäß den aktuellen guten Herstellungspraktiken (cGMP) verantwortlich ist, würde diese Strategie die Produktionskosten drastisch erhöhen und zu einer größeren Produktvariabilität führen. Um diese Probleme anzugehen, werden Roboterplattformen benötigt, die die arbeitsintensiven Schritte automatisieren können, die für die iPSC-basierte therapeutische Herstellung erforderlich sind.

In diesem Manuskript beschreiben wir die erfolgreiche Generierung patientenspezifischer iPSCs in klinischer Qualität mithilfe der Präzisionsroboterplattform Cell X™ [48]. Diese Plattform wurde entwickelt, um viele der kritischen Schritte im Zusammenhang mit der Produktion autologer Zelllinien durchzuführen, einschließlich Bildgebung, Medienaustausch, Kommissionierung, Unkrautbekämpfung und klonale Expansion von iPSCs. Durch die Platzierung der Cell-X-Plattform in einem cGMP-konformen Biospherix . Die resultierenden iPSC-abgeleiteten Nachkommen waren nicht von denen zu unterscheiden, die durch manuelle Verarbeitung erzeugt wurden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Integration der Cell

Neuprogrammierung, klonale Expansion und Netzhautdifferenzierung wurden alle unter Verwendung der Cell X™-Plattform (Cell X Technologies Inc, Cleveland, OH) durchgeführt, die in einem cGMP-konformen Biospherix konforme Reagenzien. Dermale Fibroblasten, die aus Hautbiopsien von Patienten mit angeborener degenerativer Netzhautblindheit isoliert wurden, wurden mit dem CytoTune2-Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), einem nicht integrierenden Sendai-Virus-Reprogrammierungskit, neu programmiert, wie bereits berichtet [49]. Kurz gesagt, Fibroblasten, die aus einer 3-mm-Hautstanzbiopsie isoliert und bei 37 °C und 5 % CO2 und 20 % O2 in Biopsiemedien kultiviert wurden [49]. Aus Konsistenzgründen werden am Montag 250.000 Fibroblasten in einer Vertiefung einer Kulturschale mit 6 Vertiefungen bei einer Ziel-MOI von 5 transduziert, wobei Sendai-Virusvektoren die Expression von OCT4, SOX2, KLF4 und C-MYC steuern. Das virale Reprogrammierungsmedium wird am Dienstag ausgetauscht und die Kulturen werden anschließend am Mittwoch gefüttert (dh das Medium wurde gewechselt). Am Freitag, 4 Tage nach der Transduktion, wurden die Zellen auf eine mit Laminin 521 (LN521, BioLamina, Sundbyberg, Schweden) beschichtete Kulturschale mit 6 Vertiefungen mit 5.000, 10.000 und 20.000 Zellen pro Vertiefung (d. h. 3 separate Vertiefungen) geleitet. 24 Stunden nach der Passage wurde das Medium durch vollständiges Essential 8 (E8)-Medium (CTS, Thermo Fisher Scientific) ersetzt und die Sauerstoffspannung auf 10 % gesenkt, wo sie bis nach der Kolonienernte aufrechterhalten wurde. Jedes Mal, wenn die Kultur gefüttert wurde (d. h. jeden Montag, Mittwoch und Freitag), wurde die gesamte Oberfläche der Kulturplatte mit der Cell Ausbau von iPSCs. Sobald die Kolonien eine ausreichende Größe (ca. 1,5–3 mm Durchmesser) erreicht hatten, wurden mit der Cell Wachstumsmerkmale (d. h. dicht gepackt mit klar abgegrenzter heller Phasenkante und geringer spontaner Differenzierung)), die zur Expansion jeweils in eine separate Vertiefung einer mit Laminin 521 beschichteten Kulturschale mit 12 Vertiefungen überführt wurden. Nach der Entnahme wurde die ursprüngliche Kultur erneut gescannt, um zu bestätigen, dass die gewünschten Zellen erfolgreich entfernt wurden. Nach der ersten Passage wurde die O2-Konzentration auf 20 % erhöht, iPSCs wurden täglich gefüttert und mit Versene (CTS, Thermo Fisher Scientific) auf mit Laminin 521 beschichtete Kulturschalen passagiert, sobald sie 80 % erreicht hatten. Mit Ausnahme des Transports der Zellkulturschalen zum und vom Inkubator (der von Hand durchgeführt wird) sind alle Schritte, einschließlich Bildgebung, Fütterung und Passage, automatisiert. Um eine Kontamination der Medienabgabeschläuche und des Kopfes durch das Sendai-Virus zu verhindern, wurde die Transduktion von Fibroblastenzellen manuell in der angrenzenden Zellverarbeitungskammer durchgeführt. Bei Passage 10 wurden iPSC-Linien einer Karyotypisierung und einer Scorecard-Analyse unterzogen, um die genetische Integrität und Wirksamkeit zu bestätigen. Um diesen Ansatz weiter zu validieren, wurden auf der Cell

IPSCs wurden in der Metaphase vom Shivanand R. Patil Cytogenetics and Molecular Laboratory an der University of Iowa unter Verwendung der Metaphase-Scanplattform von Leica Microsystems und der Software CytoVision Version 7.7 karyotypisiert. Die Zellen wurden in vitro gezüchtet und in der Metaphase mit Colcemid arretiert. Chromosomen wurden mit der G-Banding-Methode gefärbt, gezählt und strukturell auf das Vorhandensein oder Fehlen nachweisbarer Umlagerungen untersucht. Für jede iPSC-Linie wurden mindestens 20 Zellen analysiert. Für die TaqMan hPSC ScoreCard™-Analyse wurde die Gesamt-RNA mit dem NucleoSpin RNA-Reinigungskit (Takara Bio, San Jose, CA) isoliert. cDNA wurde aus 1 µg RNA mit dem VILO cDNA-Synthesekit (Thermo Fisher Scientific) erzeugt. cDNA wurde zu einer TaqMan hPSC-Scorecard-Platte (Thermo Fisher Scientific) gegeben und unter Verwendung eines QuantStudio 6 Flex Echtzeit-PCR-Systems amplifiziert. Die Ergebnisse wurden mit der cloudbasierten Analysesuite von Thermo Fisher analysiert.

Die Netzhautdifferenzierung wurde mit Modifikationen zur Einhaltung der GMP durchgeführt, wie zuvor beschrieben [31, 50]. IPSCs wurden auf mit Laminin 521 beschichteten Platten in E8-Medium kultiviert. Embryoidkörper (EBs) wurden mit ReLeSR (STEMCELL Technologies, Cambridge, MA) angehoben und von E8 auf neuronales Induktionsmedium (NIM-DMEM/F12 (1:1), 1 % N2-Ergänzung, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren) überführt. 1 % Glutamax (Thermo Fisher Scientific), 2 µg/ml Heparin (Sigma-Aldrich, St. Louis MO) und Primocin (InvivoGen, San Diego, CA)) über einen Zeitraum von vier Tagen. Am 6. Tag wurde NIM mit 1,5 nM BMP4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) ergänzt. Am siebten Tag wurden die EBs auf mit Maxgel beschichtete Platten (Sigma-Aldrich) geklebt. BMP4 wurde innerhalb von sieben Tagen schrittweise aus dem NIM übernommen. Am 16. Tag wurde das Medium auf Netzhautdifferenzierungsmedium (RDM – DMEM / F12 (3:1), 2 % B27-Ergänzung (Thermo Fisher Scientific), 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 1 % Glutamax und 0,2 % Primocin) umgestellt. . Am 25.–30. Tag wurde der gesamte EB-Auswuchs mechanisch mit einem Zellschaber angehoben und in 3D-RDM (RDM plus 10 % KnockOut-Serumersatz (KSR); Thermo Fisher Scientific), 100 µM Taurin (Sigma) in Flaschen mit extrem niedrigem Ansatz überführt -Aldrich), 1:1000 chemisch definiertes Lipidkonzentrat (Thermo Fisher Scientific) und 1 µM all-trans-Retinsäure (bis Tag 100; Sigma-Aldrich). Die Zellen wurden bis zur Ernte dreimal pro Woche mit 3D-RDM gefüttert.

An den Tagen 120 und 160 wurden die Organoide mit 4 % Paraformaldehyd für 30–60 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und auf 15 % Saccharose in PBS äquilibriert, gefolgt von 30 % Saccharose. Organoide wurden in einer 50:50-Lösung aus 30 % Saccharose/PBS: Gewebegefriermedium (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) kryokonserviert und kryogeschnitten (15 μm). Die Schnitte wurden mit 5 % normalem Eselserum, 3 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Triton-x blockiert und über Nacht mit den folgenden Primärantikörpern gefärbt: OTX2 (R&D Systems; Kat.-Nr. AF1979), Recoverin (EMD Millipore, Burlington, MA; Kat.-Nr. AB5585), NRL (R&D Systems; Kat.-Nr. AF2945), ARR3 (Lifespan Biosciences, Seattle, WA; Kat.-Nr. LS-C368677), ML-Opsin (EMD Millipore; Kat.-Nr. AB5405) und NR2E3 (R&D Systems; Kat.-Nr. PP-H7223-00). Die folgenden sekundären Antikörper (Thermo Fisher Scientific) wurden 1 Stunde lang inkubiert: Esel-Anti-Ziege 488 (Kat.-Nr. R37118), Esel-Anti-Maus 488 (Kat.-Nr. A21202) und Esel-Anti-Kaninchen 647 (Kat.-Nr. A31573). Zellkerne wurden mit DAPI (Thermo Fisher Scientific; Kat.-Nr. 62.248) gegengefärbt. Die Bilder wurden mit einem aufrechten konfokalen Mikroskopsystem Leica TCS SPE (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) aufgenommen.

Aus der Kultur wurden zehn repräsentative Organoide ausgewählt. Man ließ die Organoide durch Schwerkraft in einem 1,5-ml-Röhrchen absetzen und das Medium wurde abgesaugt. Anschließend wurden die Organoide mit 20 Einheiten/ml Papain (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ) mit 60 Einheiten/ml DNase I (Worthington Biochemical Corporation) auf einem Schüttler bei 37 °C etwa 60 Minuten lang dissoziiert. Nach der Dissoziation wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 400 × g pelletiert, in dPBS –/– (Thermo Fisher Scientific) mit 0,04 % nicht acetyliertem Rinderserumalbumin (New England Biolabs, Ipswich, MA) resuspendiert und sofort zur Einkapselung verarbeitet Barcode mit dem Chromium Controller (10X Genomics, Pleasanton, CA).

Die Zellen wurden durch einen 70-µm-Filter filtriert und weiter verdünnt, um 8000 Zellen pro Lauf zu erreichen. Anschließend wurden einzelne Zellen mit dem Chromium Controller-Instrument (10X Genomics) und dem Single Cell 3' Reagent (v3.1 Chemie) Kit (10X Genomics) gemäß den Herstellerangaben ohne Modifikation (Rev. C) aufgeteilt und mit einem Barcode versehen. Die endgültigen Bibliotheken wurden mit dem Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert und in Puffer EB (Qiagen, Hilden, Deutschland) auf 3 ng/µL verdünnt. Die Qualität und Konzentration der Bibliothek wurde vor der Sequenzierung mit dem Bioanalyzer High Sensitivity DNA Assay (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) bestätigt.

scRNA-Bibliotheken wurden mit dem NovaSeq 6000-Instrument (Illumina, San Diego, CA) sequenziert und erzeugten 100-bp-Paired-End-Reads. Die Sequenzierung wurde von der Genomics Division des Iowa Institute of Human Genetics durchgeführt. FASTQ-Dateien wurden aus Basisaufrufen mit der bcl2fastq-Software (Illumina) generiert und Lesevorgänge wurden mit Cell Ranger (Version 6.0) (10X Genomics) mithilfe der Funktion „count“ der vorgefertigten GRCh38-Referenz zugeordnet. Nur Zellen, die den standardmäßigen Cell Ranger-Aufruf bestanden, wurden weiter analysiert. In die Analyse wurden nur Zellen mit zwischen 500 und 7.000 eindeutigen Genen (Merkmalen) einbezogen, bei denen < 15 % der Lesevorgänge auf mtDNA-kodierte Gene und < 25 % der Lesevorgänge auf ribosomale Gene abgebildet waren.

Gefilterte Bibliotheken wurden mit Seurat normalisiert [51]. Variable Merkmale wurden vor der Skalierung und Dimensionsreduktion mit der vst-Auswahlmethode identifiziert. Um die neu generierten Daten mit bestehenden Studien zu vergleichen, wurden Daten aus diesem Manuskript mit zuvor generierten scRNA-seq-Daten der Entwicklung retinaler Organoide am Tag 90, 104 und 110 integriert [52]. Die Integration wurde mit kanonischer Korrelationsanalyse unter Verwendung des Seurat-Pakets (v3.2.3) durchgeführt. Um die Reifung von Vorläufern zu Photorezeptoren zu modellieren, wurden Zellen, die als retinale Vorläufer, Übergangszellen (T1- und T3-Populationen) und Stäbchen identifiziert wurden, vom ursprünglichen Seurat-Objekt abgeleitet. Wir haben die PHATE-Dimensionalitätsreduktion (v1.0.7) [53] auf die integrierten, skalierten Daten aus der Photorezeptor- und Vorläufer-Teilmengenpopulation angewendet. Für jede Zelle wurden insgesamt 10 nächste Nachbarn identifiziert und diese Nachbarn wurden verwendet, um den Kernel mit einem Zerfallsfaktor von 75 zu erstellen. Als nächstes wurde das Slingshot-R-Paket [54] verwendet, um eine Trajektorienanalyse unter Verwendung der PHATE-Einbettungen zu erstellen die Flugbahn beginnt bei der Vorläuferpopulation.

Die Cell der iPSC-Fertigungspipeline. Konkret besteht die Cell Durchführung des Medienaustauschs und eine separate peristaltische Pumpe, die mit einer unabhängigen Aspirationsleitung (Abb. 1A2 und B2) verbunden ist und für die Medienaspiration verwendet wird. Sowohl die Spritzenpumpe als auch die Aspirationspumpe können Einweg-Mikropipettenspitzen aufnehmen und entsorgen, um aseptische Zellkulturbedingungen aufrechtzuerhalten (Abb. 1E). Diese Liquid-Handling-Plattform basiert auf einem automatisierten Umkehrmikroskop mit Phasen- und Fluoreszenzfunktionen (Abb. 1A), das die Verfolgung von Kulturen von der Fibroblastenisolierung über die iPSC-Koloniebildung bis zur klonalen Expansion ermöglicht. Mithilfe der Phasenmikroskopie, die 7 Tage nach der Fibroblastentransduktion begann, konnten wir beispielsweise die iPSC-Koloniebildung über einen Zeitraum von 15 Tagen verfolgen. (Abb. 1F–J).

Die Cell X Robotic-Plattform zur automatisierten Erzeugung von iPSCs aus primären dermalen Fibroblasten. A Die Cell Bis zu zwei Standard-Multiwellplatten können auf dem System (A5) platziert werden, das in der Lage ist, die Kulturen abzubilden, Medienaustausche durchzuführen, unerwünschte Zellen zu entfernen und iPSC-Kolonien zu pflücken, die dann in verschiedene Wells oder Platten übertragen werden können. A1 = Spritzenpumpe, A2 = Aspirationspumpe, A3 = Medienausgabepumpenkopf, A4 = Einweg-Mikropipettenspitzen für die Spritze und die Aspirationspumpen, A5 = Robotertisch, der zwei Multiwell-Zellkulturplatten hält, A6 = Peristaltikpumpen, die Medienversorgung an A3, A7 = automatisiertes Mikroskop. B Die Cell Reagenzien in einzelne Vertiefungen. C Die Abgabe flüssiger Reagenzien und das Absaugen erfolgt mithilfe softwaregesteuerter peristaltischer Pumpen. D Drei verschiedene flüssige Reagenzien können über separate Dosiernadeln in die Vertiefungen gegeben werden. E Sowohl die Spritze als auch die Absaugpumpe verwenden Einweg-Mikropipettenspitzen, um aseptische Zellkulturbedingungen sicherzustellen und eine Kreuzkontamination zwischen Proben zu verhindern. F–J Die automatisierten Bildgebungsfunktionen der Cell X-Plattform ermöglichen die Überwachung des Wachstums einzelner iPSC-Kolonien im Laufe der Zeit. K Während dieser Studie haben wir Cell

Die Auswahl von iPSCs für die klonale Expansion und das Entfernen restlicher somatischer Zellen oder Zonen spontaner Differenzierung sind zwei der arbeitsintensivsten Schritte in modernen Protokollen zur iPSC-Generierung. Nachdem aus einem Patienten isolierte somatische Zellen mit Reprogrammierungsfaktoren transduziert wurden, muss die resultierende Kultur mehrere Wochen lang aufrechterhalten und überwacht werden, bevor die reprogrammierten iPSC-Kolonien groß genug werden, um ausgewählt zu werden (d. h. ~ 1,5–3 mm im Durchmesser). Während dieser Zeit müssen die somatischen Zellen, aus denen die iPSCs abgeleitet wurden, möglicherweise entfernt oder „aussortiert“ werden, um zu verhindern, dass sie die neu programmierten iPSCs verdrängen. Sobald die iPSC-Kolonien eine ausreichende Größe erreicht haben, müssen sie geerntet oder „gepflückt“ und zur klonalen Expansion in einzelne Zellkulturgefäße replattiert werden. Während die ausgewählten iPSCs klonal expandiert werden, müssen alle Regionen, die spontan zu differenzieren beginnen, entfernt werden, um die Integrität der iPSC-Kultur aufrechtzuerhalten. Bei Zelllinien mit übermäßiger spontaner Differenzierung kann es notwendig sein, die gewünschten Zellen erneut zu pflücken, anstatt die unerwünschten Zellen auszusortieren. Das Pflücken und Jäten erfolgt typischerweise manuell auf einem Phasenmikroskop mit einer Mikropipette. Diese Aufgaben sind zeitaufwändig und erfordern hochqualifiziertes Personal, insbesondere wenn sie unter cGMP durchgeführt werden. Daher würde die Automatisierung dieser Verfahren einen Engpass in der Therapieproduktionspipeline beseitigen, was wiederum den Durchsatz erhöhen würde. Um Standardarbeitsanweisungen für die automatisierte iPSC-Erzeugung zu erstellen und zu validieren, die das Pflücken, Jäten und klonale Wachstum umfasst, wurden dermale Fibroblasten, die von den 21 in Abb. 1K aufgeführten Personen gewonnen wurden, erweitert und neu programmiert. Diese Kohorte wurde ausgewählt, da sie ein breites Altersspektrum aufwies (14 bis 88 Jahre mit einem Durchschnittsalter von 50,2 Jahren), sowohl 8 Männer als auch 13 Frauen umfasste und sowohl normale Personen (d. h. ND = keine Krankheit) als auch Patienten mit häufigen ( d. h. ABCA4-assoziierte) und seltene (d. h. CRB1-assoziierte) Formen der molekular bestätigten vererbten Netzhautdegeneration.

Die Cell Um die Lebensfähigkeit und Pluripotenz der Zellen aufrechtzuerhalten, ist es wichtig, die zum Anheben der Zellen verwendete Flüssigkeitsscherung zu minimieren. Um die Pick-Parameter (Spitzenhöhe, Aspirationsvolumen und Aspirationsrate) zu optimieren, wurden iPSC-Kulturen 25–30 Tage nach der Transduktion gepickt (Abb. 2A). Zu diesem Zeitpunkt sind große, dichte Kolonien mit einem Durchmesser zwischen 1,5 und 3 mm vorhanden. Wie in Abb. 2 dargestellt, umfasst der Entnahmevorgang das Platzieren einer sterilen Spitze, die mit der Spritzenpumpe verbunden ist, in der Spenderplatte über einer Kolonie und das Absaugen des gewünschten Medienvolumens mit einer definierten Geschwindigkeit (B), bevor der Tisch (C) von der Kolonie bewegt wird Geben Sie die Spenderplatte in die gewünschte Vertiefung der Empfängerplatte, wo die Probe in eine Vertiefung mit Kulturmedium (D) verteilt wird. Der Außendurchmesser der Picking-Pipettenspitze beträgt 733 μm und die Anzahl der Picks, die zur Auswahl einer gesamten Kolonie erforderlich sind, wird durch die Koloniegröße bestimmt. Um den Pflückvorgang zu beschleunigen, können bei der Pflückung einer einzelnen Kolonie mehrere Pflückvorgänge durchgeführt werden, bevor von der Spenderplatte zur Empfängerplatte übergegangen wird. Nachdem eine ganze Kolonie gepflückt wurde, wird die Mikropipettenspitze ersetzt, bevor die nächste Kolonie gepflückt wird.

Automatisierte Kommissionierung von patienteneigenen iPSCs. A Nach der Neuprogrammierung wurde das Wachstum von iPSC-Kolonien, die aus primären dermalen Fibroblasten erzeugt wurden, mithilfe der Cell B–D Sobald die transformierten iPSC-Kolonien eine ausreichende Größe erreicht hatten, wurde die Roboterspritzenpumpe der Cell Die Cell X-Plattform ist in der Lage, Einweg-Mikropipettenspitzen automatisch zu montieren und zu entfernen, um aseptische Zellkulturbedingungen aufrechtzuerhalten. E–G: Die zur Auswahl der iPSCs verwendeten Aspirationsraten wurden optimiert, um die niedrigsten Werte der Fluidscherung zu finden, die zum Anheben der Zellen erforderlich sind. Da die maximale Scherspannung unter dem Rand der Mikropipettenspitze auftritt, werden Zellen aus einem ringförmigen Bereich unterhalb dieses Randes angehoben. H–J Überlappende Pickpunkte ermöglichen das Picken ganzer Kolonien, ohne die maximal angewendete Fluidscherung zu erhöhen

Wie in Abb. 2E-G dargestellt, sammelt die Cell Durch Erhöhen der Ansauggeschwindigkeit der Spritzenpumpe könnten zwar vollständige Kreise aufgenommen werden, dies würde jedoch die maximal angelegte Scherung über das erforderliche Maß hinaus erhöhen und die zu sammelnden Zellen übermäßig belasten. Stattdessen haben wir uns dafür entschieden, komplette Kolonien durch Überlappung mehrerer Aufnahmepunkte zu sammeln (Abb. 2H–J), was eine optimale Aufnahmepräzision und ein erhöhtes Zellüberleben ermöglicht. Wenn Sie diese Funktion verwenden, um unerwünschte spontane Differenzierung zu unterbinden und somatische Zellen frühzeitig im Neuprogrammierungsprozess zu entfernen, können die Aspirationsgeschwindigkeit und das Aspirationsvolumen erhöht werden, um eine vollständige Entfernung zu ermöglichen.

IPSCs, die mit der Cell Die TaqMan hPSC Scorecard-Analyse zeigte, dass mit der Cell Als nächstes haben wir zuvor veröffentlichte Netzhautdifferenzierungsprotokolle [31, 50] so geändert, dass sie cGMP-konform sind (Abb. 4A), und iPSCs (B1427) wurden im Biospherix Xvivo-System differenziert. Die Zellen zeigten in verschiedenen Stadien der Netzhautdifferenzierung eine normale Morphologie: iPSC (Abb. 4B), Tag 7 Embryoidkörper (EBs) (Abb. 4C), an Tag 16 befestigte Sehnervenbläschen (Abb. 4D) und angehobene Netzhautorganoide (Abb. 4E). ). An Tag 120 oder Tag 160 analysierte Organoide exprimierten die Photorezeptormarker OTX2, Recoverin, NRL, NR2E3, ARR3 und ML-Opsin (Abb. 4F – N). Fibroblasten aus derselben Biopsie (B1427) wurden manuell umprogrammiert und zeigten nach verschiedenen Stadien der Netzhautdifferenzierung eine ähnliche Morphologie und Färbung (Zusatzdatei 1: Abb. S1).

Validierung von iPSCs, die auf der Cell X-Plattform generiert wurden. AA repräsentative Cell-X-Phasenmikroskopaufnahme von iPSCs, die auf der Cell-X-Plattform generiert wurden. BA repräsentativer Karyotyp von B1427-iPSCs. C–E TaqMan hPSC Scorecard-Analyse zum Vergleich von iPSCs, die durch manuelle oder automatisierte Verarbeitung generiert wurden, und ihren Tag-7-EBs. C Diagramm zum Vergleich der Algorithmuswerte für die Expression von Genen, die an der Selbsterneuerung oder der Ektodermlinie beteiligt sind. Der undifferenzierte Referenzsatz wird durch den Black-Box-Plot angezeigt. D Korrelationskoeffizienten (r2-Werte). E Expressionsdiagramme, die die fache Änderung der Expression der angegebenen Gene im Vergleich zum undifferenzierten Referenzsatz zeigen

Netzhautdifferenzierung von iPSCs, die auf der Cell X-Plattform generiert wurden. Ein Schema des Netzhautdifferenzierungsprotokolls. Repräsentative Phasenmikroskopaufnahme von Tag 0 iPSCs (B), Tag 7 EBs (C), Tag 16 befestigten Sehnervenbläschen (D) und Tag 55 angehobenen Netzhautorganoiden. Maßstabsbalken = 1 mm. Immunhistochemische Färbung von Netzhautorganoiden am Tag 120 (F–I) und am Tag 160 (J–N). Antikörper zielten auf die Photorezeptorzellmarker OTX2 (grün) und Recoverin (rot), die Stäbchenphotorezeptorzellmarker NRL und NR2E3 (grün) sowie die Zapfenphotorezeptorzellmarker ARR3 und ML-Opsin (rot). Als nukleare Gegenfärbung wurde DAPI (blau) verwendet

Um die zelluläre Zusammensetzung und Reifung von Organoiden zu untersuchen, die sich von iPSCs unterscheiden, die auf der Cell X-Plattform generiert wurden, wurde Einzelzell-RNA-Sequenzierung verwendet. Einzelne Zellen wurden am Differenzierungstag 120 (D120) aus Netzhautorganoiden gewonnen und anhand von Genexpressionsprofilen mit Anmerkungen versehen (Abb. 5A). Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Vorläufer- und Übergangspopulationen wurden alle Hauptklassen neuronaler Netzhautzellen gewonnen [52]. Die Expression bekannter Photorezeptor-Markergene wurde bestätigt (Abb. 5B), wobei Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptortypen durch NRL- bzw. PDE6H-Expression unterschieden werden konnten. Als nächstes untersuchten wir die Differenzierungslinie der Stäbchen, indem wir nur Zellen im Progenitor, T1/T3 (Übergangsvorläuferpopulationen, die sich zu Photorezeptorlinien entwickeln [52] und Stäbchencluster) unterteilen. Diese Zellen wurden mit PHATE, einer Methode zur Konservierung, zweidimensional visualisiert globale Struktur- und Zellzustandsübergänge [53] (Abb. 5C). Es wurde eine klare Flugbahn durch die erwarteten Zelltypen beobachtet, die zeigt, dass von Organoiden abgeleitete Zellen in unserem System bekannten Entwicklungslinien folgen. Als nächstes haben wir unsere Daten mit der Einzelzell-RNA-Sequenzierung integriert Daten von Netzhautorganoiden, generiert von Sridhar et al. [52]. Die Dimensionsreduktion wurde am neuen integrierten Datensatz durchgeführt und die Zellen wurden wie oben beschrieben mit Anmerkungen versehen (Abb. 5D). Jeder Cluster im resultierenden integrierten Datensatz enthielt Zellen aus der aktuellen Studie sowie die von Sridhar et al. (Abb. 5D), was auf Ähnlichkeit in den Transkriptionsprofilen von Netzhautzellen hinweist, die aus iPSCs erzeugt wurden, die mit der Cell-X-Plattform hergestellt wurden, und solchen, die manuell in einem anderen Labor erzeugt wurden.

Genexpression in einzelnen Zellen aus Netzhautorganoiden. Eine zweidimensionale (einheitliche Mannigfaltigkeitsnäherung und -projektion) UMAP-Einbettung von aus Organoiden stammenden Zellen zeigt das Vorhandensein unterschiedlicher neuronaler Netzhautzelltypen am Tag 120 der Differenzierung. B Die Expression zelltypspezifischer Markergene wird anhand der Schattierung einzelner Zellen dargestellt. Stäbchen-Photorezeptoren exprimieren NRL, Zapfen-Photorezeptoren exprimieren PDE6H, alle Photorezeptoren exprimieren RCVRN und Vorläufer- und innere Netzhautpopulationen exprimieren PAX6. C Die zweidimensionale PHATE-Einbettung von Zellen in die Stäbchenlinie zeigt von Organoiden abgeleitete Zellen in verschiedenen Differenzierungsstadien. D Zweidimensionale UMAP-Einbettung von aus Organoiden stammenden Zellen aus dieser Studie, integriert mit denen aus einer früheren Studie [52]. E Zellen in D, gefärbt durch Herkunftsstudie. UI = Zellen aus der aktuellen Studie (generiert an der University of Iowa), UW = Zellen aus einer früheren Studie ([52] generiert an der University of Washington). Die mit der in der aktuellen Studie beschriebenen Methode erzeugten Zellen integrieren sich effizient in die zuvor beschriebenen

Die Entdeckung, dass pluripotente Stammzellen aus dermalen Fibroblasten durch erzwungene Expression der Gene c-MYC, OCT-3/4, KLF4, SOX2 erzeugt werden können [55], revolutionierte das Gebiet der regenerativen Medizin. Zuvor waren pluripotente ESCs der günstigste Zelltyp, der für klinische Zellersatzlabore verfügbar war. Die weit verbreitete Verwendung menschlicher ESCs ermöglichte die Entwicklung hochwirksamer Differenzierungsprotokolle, einschließlich solcher, die für die Ableitung transplantierbarer retinaler Vorläufer- und Photorezeptor-Vorläuferzellen konzipiert sind [9, 10, 14, 15, 17, 28, 30, 36, 37, 38, 39].

Da ESCs gut für die klinische Herstellung in großem Maßstab geeignet sind, bleiben sie trotz ihrer allogenen Natur und der wahrscheinlichen Notwendigkeit einer lebenslangen Immunsuppression nach der Transplantation eine weit verbreitete Zellquelle für den klinischen Zellersatz. Obwohl von Patienten stammende iPSCs Bedenken hinsichtlich der Zuordnung von Wirt und Spender verringern, ist für die Realisierbarkeit des autologen iPSC-vermittelten Zellersatzes die Entwicklung cGMP-konformer Herstellungstechnologien erforderlich, die die parallele Produktion mehrerer Zelllinien durch einen einzigen Techniker ermöglichen. Zu diesem Zweck berichten wir über die Entwicklung der Cell Die Cell

Einer der größten Vorteile der Verwendung einer Roboter-Zellkulturplattform wie der Cell X-Plattform ist die Möglichkeit, Aufgaben in Abwesenheit eines Benutzers auszuführen. Sobald die Befehle bereitgestellt wurden, kann man sich darauf verlassen, dass die Cell X-Plattform Tag für Tag eine Reihe validierter Aufgaben auf die gleiche Weise ausführt. Dies kann nicht nur den Durchsatz erhöhen, sondern auch die Produktvariabilität von Charge zu Charge verringern, sodass man sicher sein kann, dass biologische Unterschiede zwischen Zelllinien wahrscheinlich nicht auf menschliches Versagen, Inkonsistenzen aufgrund geringfügiger technischer Abweichungen oder Protokolle zurückzuführen sind Drift. Vor der Implementierung eines Robotersystems in eine Fertigungspipeline müssen Standardarbeitsanweisungen für die spezifische Anwendung entwickelt und validiert werden. In dieser Studie waren wir an der Entwicklung eines Systems interessiert, das in der Lage ist, dermale Fibroblasten von Patienten von der Isolation über die Neuprogrammierung bis zur klonalen Expansion zu verfolgen. Darüber hinaus bestand ein Hauptziel darin, den Prozess der iPSC-Kommissionierung zu automatisieren, eine Aufgabe, die für das technische Personal sowohl zeitaufwändig als auch schwierig manuell durchzuführen ist, insbesondere wenn es in voller Reinraumkleidung ist. Die von uns verwendete Kommissionierungsstrategie nutzt eine Spritzenpumpe, um ausgewählte iPSC-Kolonien anzusaugen und abzugeben. Wie in Abb. 2 dargestellt, ermöglicht die strategische Platzierung des Pflückrings entweder die Pflückung der gesamten Kolonie oder Teilpflückungen. Letztere sind sehr nützlich für die Probenahme und Analyse nach der CRISPR-vermittelten Genombearbeitung. Zusätzlich zu ihrem Nutzen zur Isolierung gewünschter Zellpopulationen kann die Spritzenpumpe auch zur Entfernung unerwünschter spontan differenzierter Zelltypen verwendet werden. In Bereichen, in denen die spontane Differenzierung minimal ist, können die differenzierten Zellen abgesaugt und als Abfall abgegeben werden. Wenn größere Bereiche spontaner Differenzierung vorhanden sind, kann die an der Spritzenpumpe angebrachte Pipettenspitze verwendet werden, um die unerwünschten Zelltypen abzukratzen, und der Aspirator, der von einer unabhängigen peristaltischen Pumpe gesteuert wird, kann das Medium und die schwimmenden Rückstände entfernen. Die Integration von drei zusätzlichen peristaltischen Pumpen, von denen jede an ein unabhängiges Medienreservoir angeschlossen werden kann, bietet dem Benutzer die Möglichkeit, einen Waschschritt und eine Mediennachfüllung zu integrieren, um unerwünschte Zelltypen vollständig zu entfernen. In späteren Stadien der iPSC-Expansion, in denen das Picken von iPSCs und die Beseitigung der spontanen Differenzierung seltener werden, kann die dritte peristaltische Pumpe verwendet werden, um eine nichtenzymatische Passagelösung wie Versene für die groß angelegte Passage klonal expandierter Zelllinien zu liefern.

Es wurde über mehrere Roboter-Zellkultursysteme berichtet, die von kleinen Liquid-Handling-Geräten (56, 57) bis hin zu großen eigenständigen Multifunktionsplattformen (58,59,60,61,62,63,64,65,66) reichen. Beispielsweise ist die von Tristan et al. am National Center for Advancing Translational Sciences entwickelte CompacT SelecT (CTST)-Plattform eine große eigenständige Einheit, die einen Inkubator, ein Mikroskop, einen Zellzähler, mehrere peristaltische Pumpen und einen gekühlten Medienspeicher umfasst Bereich und Roboter-Plattenhandhabungsgerät [58]. Mit diesem System demonstrierten die Autoren die gleichzeitige Kultivierung von bis zu 90 menschlichen iPSC-Linien für eine längere Passage, ohne karyotypische Anomalien oder einen Potenzverlust hervorzurufen [58]. In einer aktuellen Veröffentlichung beschrieben Elanzew und Kollegen ein ähnliches System, das sie StemCellFactory nannten [59]. Im Gegensatz zum CTST, das als eigenständiges Gerät fungiert, das in einer bestehenden Produktionsanlage platziert werden kann, ist die StemCellFactory eine modulare Einheit mit mehr als 30 integrierten Instrumenten, die alle in einer großen, maßgeschneiderten Laminar-Flow-Haube untergebracht sind, die einem ähnelt Reinraum [59]. Zusätzlich zu einem speziellen Liquid-Handling-Gerät, zwei Zellkultur-Inkubatoren, einem automatisierten Mikroskop und einem Roboter-Plattenbeweger umfasst dieses System eine kommerziell erhältliche Einzelzell-/Kolonie-Picking-Plattform (CellCelector™, Sartorius), die zur Ermöglichung der hiPSC-Erzeugung verwendet wird und Expansion [59]. Wie oben beschrieben, wurde die Cell

Da der Cell In dieser Studie haben wir uns dafür entschieden, die Cell X-Plattform in einem cGMP-konformen Biospherix Insbesondere wird die gesamte Einheit, zu der die Laminar-Flow-Haube mit der Cell für die spezifische Aufgabe, die ausgeführt wird. Es hat sich gezeigt, dass eine verringerte Sauerstoffspannung die Geschwindigkeit der iPSC-Neuprogrammierung erhöht [67]. Da die Neuprogrammierung somatischer Zellen älterer Menschen schwierig sein kann [68], kann die Fähigkeit, den Luftsauerstoffdruck zu senken, außerordentlich nützlich sein. In dieser Studie wurden von Patienten stammende iPSCs erzeugt, ausgewählt, klonal expandiert und bei einer Sauerstoffspannung von 10 % gehalten. Sobald die Neuprogrammierung abgeschlossen war, wurde die Sauerstoffspannung für eine langfristige iPSC-Kultur und 3D-Netzhautdifferenzierung auf 20 % erhöht. In späteren Stadien der Differenzierung können Netzhautorganoide groß und schwer zu durchbluten sein. Um die Lebensfähigkeit der Netzhautzellen unter erweiterten Kulturbedingungen zu verbessern, wurden erhöhte Sauerstoffwerte verwendet. Beispielsweise berichteten Nakano und Kollegen in einem der ersten veröffentlichten Protokolle über die Kultur von 3D-Netzhautorganoiden unter 40 % Sauerstoffspannung [30], was mit der hier beschriebenen kombinierten Biospherix/Cell

Im Gegensatz zum CTST und der StemCellFactory, die über Roboterarme verfügen, die Zellkulturschalen von einer Station zur nächsten transportieren, muss beim Einsatz des Cell Um eine kontinuierliche Fertigung zu ermöglichen, werden derzeit ein kollaborativer 6-Achsen-Roboterarm (Universal Robots, Odense, Dänemark), ein Hochleistungsinkubator (Liconic STX-500, Mauren, Liechtenstein) und eine kundenspezifische Masterplanungssoftware integriert. Der 6-Achsen-Roboterarm bewegt Platten mit Zellen aus dem Hochleistungsinkubator und Verbrauchsmaterialien von ihren Lagerorten auf die Cell Die benutzerdefinierte Master-Planungssoftware soll es einem Techniker ermöglichen, eine Reihe von Aufgaben für jede Zelllinie festzulegen, vom Beginn der Neuprogrammierung bis zur Netzhautdifferenzierung, die je nach Bedarf je nach Echtzeit-Datenanalyse geändert werden können. Wenn bei der Überprüfung der Bilddaten festgestellt wird, dass ein Folgeschritt früher oder später als ursprünglich geplant durchgeführt werden muss, kann das Datum geändert und alle nachgelagerten Schritte entsprechend angepasst werden. Das in dieser Studie verwendete iPSC-Generierungsprotokoll sieht beispielsweise vor, dass die ersten Kolonien etwa 25 Tage nach der Sendai-Virustransduktion der dermalen Fibroblasten des Patienten gepflückt werden. Wenn der ursprüngliche Zeitplan darauf eingestellt war, transduzierte Zellen täglich abzubilden und zu füttern und die Kolonien am 25. Tag zu pflücken, die Datenüberprüfung am 24. Tag jedoch ergab, dass die Kolonien langsamer wuchsen und noch nicht die gewünschte Größe erreicht hatten, könnte sich das Pflücken und die anschließende Aufnahme verzögern Die klonalen Expansions-, Passage- und Differenzierungsdaten passen sich entsprechend an.

In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass die Cell Da es die gesamte Zellkulturoberfläche bei jeder Frequenz abbilden kann, ermöglicht es ein Maß an Nachverfolgbarkeit, das mit Standard-Zellkultur- und Bildgebungsansätzen nicht möglich ist. Obwohl die Protokollentwicklung von entscheidender Bedeutung ist, kann die Plattform nach der Validierung einer mit Cell Zusammengenommen steigern diese Funktionen sowohl die Produktionskapazität eines einzelnen Technikers als auch die Qualität des zu entwickelnden Produkts erheblich und machen es ideal für die Integration in eine klinische Produktionspipeline.

Die Einzelzell-RNA-Expressionsdaten, die die in dieser Studie präsentierten Ergebnisse stützen, werden vollständig gemeldet und stehen zum öffentlichen Download zur Verfügung (GEO # GSE220154). Alle weiteren Daten finden Sie im Artikel und im Online-Ergänzungsmaterial.

Periphäres Nervensystem

Zentrales Nervensystem

Induzierte pluripotente Stammzellen

Essential 8 mittel

Embryonische Stammzellen

Aktuelle gute Herstellungspraktiken

Embryoide Körper

Keine Krankheit

Einzelzell-RNA-Sequenzierung

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Referenzen herunterladen

Die hier präsentierten RNA-seq-Daten wurden von der Genomics Division des Iowa Institute of Human Genetics erstellt, die teilweise vom Carver College of Medicine der University of Iowa unterstützt wird.

Diese Forschung wurde von den National Institutes of Health R01 EY033331 finanziert.

Institut für Sehforschung, Carver College of Medicine, University of Iowa, 375 Newton Road, Iowa City, IA, 52242, USA

Laura R. Bohrer, Nicholas E. Stone, Nathaniel K. Mullin, Andrew P. Voigt, Kristin R. Anfinson, Jessica L. Fick, Robert F. Mullins, Edwin M. Stone und Budd A. Tucker

Abteilung für Augenheilkunde und visuelle Wissenschaften, Carver College of Medicine, University of Iowa, Iowa City, IA, USA

Laura R. Bohrer, Nicholas E. Stone, Nathaniel K. Mullin, Andrew P. Voigt, Kristin R. Anfinson, Jessica L. Fick, Robert F. Mullins, Edwin M. Stone und Budd A. Tucker

Abteilung für Biomedizinische Informatik, Ohio State University, Columbus, OH, USA

Bradley Hittle und Kimerly Powell

Abteilung für Biomedizintechnik, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA

Viviane Luangphakdy & George F. Muschler

Abteilung für orthopädische Chirurgie, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA

George F. Muschler

Cell X Technologies Inc, Cleveland, OH, USA

Viviane Luangphakdy

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LRB, NES, NKM, BH, KP, VL, GM, RFM, EMS und BAT konzipierten und gestalteten die Experimente und interpretierten die Daten. LRB, NKM, KRA und APV führten die Experimente durch, sammelten und analysierten die Daten. LRB, NES, NKM, RFM, EMS, BAT haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Budd A. Tucker.

Diese Studie wurde vom Institutional Review Board der University of Iowa genehmigt (Projektgenehmigungsnummer 200202022) und entsprach den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki.

Unzutreffend.

KP ist ein bezahlter Berater und Anteilseigner von Cell X Technologies Inc. GM ist Chief Technology Officer und Anteilseigner von Cell X Technologies Inc. VL ist Angestellter und Anteilseigner von Cell X Technologies Inc.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Netzhautdifferenzierung manuell generierter iPSCs. Repräsentative Phasenmikroskopaufnahme von Tag 0 iPSCs (A), Tag 7 EBs (B) und Tag 40 angehobenen Netzhautorganoiden (C). Maßstabsbalken = 250 μm (A) und 1 mm (B, C). Immunhistochemische Färbung von Netzhautorganoiden am Tag 120 (D–G) und am Tag 160 (H–N). Antikörper zielten auf die Photorezeptorzellmarker OTX2 (rot) und Recoverin (grün), die Stäbchenphotorezeptorzellmarker NRL (rot) und NR2E3 (grün) und die Zapfenphotorezeptorzellmarker ARR3 (grün (D, E, H, I) und rot ( L, N)). Als nukleare Gegenfärbung wurde DAPI (blau) verwendet

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bohrer, LR, Stone, NE, Mullin, NK et al. Automatisierung der iPSC-Erzeugung, um eine autologe Photorezeptorzellersatztherapie zu ermöglichen. J Transl Med 21, 161 (2023). https://doi.org/10.1186/s12967-023-03966-2

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Eingegangen: 09. Dezember 2022

Angenommen: 03. Februar 2023

Veröffentlicht: 28. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-023-03966-2

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