Zellernte – kulturell werden

Peter Rose von Alfa Laval wirft einen Blick auf einen der Wachstumsbereiche der biopharmazeutischen Filtration und Trennung: die Ernte von Säugetierzellen zur Herstellung neuer Medikamente und Medikamente. Der Artikel untersucht die Ursprünge der in diesem Industriezweig eingesetzten Technologie und geht auf aktuelle Entwicklungen ein.

Wir – also Säugetiere – bestehen aus Zellen. Das Spiegelbild, das Ihnen im Spiegel gegenübersteht, sieht zwar ziemlich solide aus, aber was Sie wirklich sehen, sind etwa 10 Billionen Zellen, die in etwa 200 verschiedene Typen aufgeteilt sind. Diese Zellgruppen sind ziemlich spezialisiert: Lebern bestehen aus Leberzellen, Muskeln aus spezialisierten Muskelzellen und so weiter.

Das Züchten und Ernten von Säugetierzellen außerhalb des Körpers und im Labor oder in der Fabrik zur Herstellung neuer Medikamente und Medikamente ist einer der aufregendsten Zweige der modernen Life-Science-Industrie. Doch so weit hergeholt es auch erscheinen mag, diese enormen Fortschritte in der medizinischen Wissenschaft lassen sich auf ein Huhn zurückführen, das irgendwann Ende des 19. Jahrhunderts seziert wurde; 1885 um genau zu sein. Damals gelang es Wilhelm Roux, die Markplatte des besagten Hühnerembryos mehrere Tage lang in einer warmen Salzlösung zu halten und etablierte damit erstmals das Prinzip der Gewebekultur.

Seine Arbeit wurde im ersten Jahrzehnt des 20. Jahrhunderts von Wissenschaftlern der John Hopkins Medical School und der Yale University in mehreren Schritten weiterentwickelt. In den 1940er und 1950er Jahren wurden in Zellkulturen gezüchtete Viren zur Herstellung von Impfstoffen verwendet. Die Polio-Impfstoffe, die die Gefahr der Krankheit endgültig beseitigten, wurden in Zellkulturen aus Affennieren gezüchtet.

Heutzutage ist die Arzneimittelproduktion auf Zellkulturbasis natürlich einer der am schnellsten wachsenden Bereiche der Biotechnologie. Sein schneller Erfolg ist vor allem der parallelen Entwicklung von Technologien für die drei Schlüsselphasen des Zellkulturwachstums zu verdanken: Fermentation, Ernte und Reinigung.

Die Ernte erfolgt durch die Trennung der Zellkultur vom Wachstumsmedium. Für diesen heiklen Vorgang kommen verschiedene Techniken zum Einsatz. Zentrifugation, Mikrofiltration, Tiefenfiltration und Filtration durch Membranen mit absoluter Porengröße. Von den verschiedenen Techniken ist die Zentrifugation diejenige, die am häufigsten von der Labor- auf die Fabrikproduktionsebene übertragen wird.

Die Zentrifugation nutzt den Dichteunterschied zwischen Feststoffen und der umgebenden Flüssigkeit und beschleunigt das Absetzen, das normalerweise bei der Sedimentation auftritt. Bei den meisten industriellen Anwendungen werden Tellerzentrifugen eingesetzt, um Zellen und Zelltrümmer aus der Nährbrühe zu entfernen. Scheibenzentrifugen bieten einen kontinuierlichen Betrieb, sodass ihr Durchsatz dem Wunsch entspricht, die Zeit für Erntevorgänge zu begrenzen.

Natürlich ist es nicht ganz so einfach, wie es scheint. Säugetierzellen sind sehr zerbrechliche Organismen. Obwohl eine Tellerzentrifuge die Trennung relativ einfach macht, besteht der Trick darin, dies mit minimaler Beschädigung des Produkts zu tun. Die Beschleunigung des proteinreichen Futtermaterials dauert den Bruchteil einer Sekunde. Aber auch wenn Schnelligkeit von entscheidender Bedeutung ist, darf sie nicht auf Kosten der Zerstörung der äußerst scherempfindlichen Zellwandmembran gehen, die unerwünschte intrazelluläre Proteine ​​in die Brühe freisetzen würde – ein Prozess, der als Lyse bezeichnet wird.

Durch die Verhinderung zusätzlicher Lyse während der Beschleunigung ist es möglich, die Kapazität des Separators zu erhöhen und gleichzeitig das erforderliche Trennergebnis zu erzielen. Auch die nachgeschaltete Reinigung der Zielproteine ​​wird vereinfacht und kann mit kompakteren Geräten durchgeführt werden, was zu erheblichen Einsparungen im Prozess führt. Die Herausforderung besteht also darin, eine maximale Trenneffizienz bei minimaler Produktstörung zu erreichen.

So wie sich die Zellkultur aus relativ bescheidenen Anfängen entwickelt hat, so haben sich auch die Geräte entwickelt, mit denen sie geerntet wird. Tatsächlich wurde bereits in den frühesten Stadien der Zellkulturwissenschaft, als Alfa Laval mit Branchenführern an der Entwicklung groß angelegter Zellkulturfermentationen arbeitete, schnell klar, dass die Eigenschaften von Zellkulturen äußerst schonende Separatorkonstruktionen erforderten. Sie wandten sich der Hohlspindel zu, deren Ursprung auf ursprünglich für die Milchindustrie entwickelte Konzepte zurückzuführen war, bei denen durch sanfte Berührung verhindert wurde, dass Fettpartikel in der Milch beim Beschleunigen auseinanderscheren. Jahrzehnte später ist dieselbe Technologie ein Eckpfeiler der modernen Zellkulturverarbeitung.

Wie bei vielen Innovationen hatte der anfängliche Impuls wenig mit dem letztendlichen Ergebnis zu tun. Als die Ingenieure von Alfa Laval ursprünglich beschlossen, die Machbarkeit eines Separators zu untersuchen, der eine Flüssigkeitsableitung unter Druck ermöglicht, hatten sie Bier und nicht Milch im Sinn. Ziel war die Reinigung des Bieres durch Trennung ohne Lufteintritt und unter ausreichendem Druck, um den Verlust von Kohlendioxid zu verhindern.

Der einzig vernünftige Weg, ein geschlossenes System zu erreichen, bestand darin, die Flüssigkeit der Schüssel von unten durch eine rohrförmige Schüsselspindel zuzuführen und sie am Schüsselhals abzulassen. Eine Versuchsmaschine zur Klärung von Bier wurde gebaut, aber auch mit Milch getestet, da man der Meinung war, dass die Maschine das Milchschaumproblem lösen könnte, was auch der Fall war.

Das Milchverfahren schien damals das wirtschaftlich rentablere zu sein. Die Ingenieure modifizierten die ursprüngliche Maschine mit zwei Ausgängen, sodass sie auch als Sahneabscheider verwendet werden konnte. Versuche in einer schwedischen Molkerei erwiesen sich als so erfolgreich, dass Alfa Laval daraufhin eine Reihe der neuen Separatoren produzierte, die 1933 auf der Ausstellung der Deutschen Landwirtschaftlischen Gesellschaft in Berlin ausgestellt wurden. Dieser erste hermetische Abscheider veränderte von da an die Molkerei- und Brauereitechnologie radikal.

Wie es sich für ein völlig anderes Gerät gehörte, sah der hermetische Hohlspindelabscheider völlig anders aus als frühere Zentrifugen. Der Rahmen wurde so konstruiert, dass die Einlässe für Vollmilch an der Unterseite der Maschine leicht zugänglich waren.

Weder die traditionelle zweiteilige Schüsselspindel noch die neuere Spindel vom baltischen Typ konnten verwendet werden. Daher musste der hermetische Abscheider ein völlig neues Spindeldesign aufweisen. Die Lösung bestand darin, die Spindel vom damals größten Hefeseparator von Alfa Laval, dem OVK 5, zu adaptieren.

Am oberen Ende der Spindel, direkt unter der Schüssel, trug das flexible obere Lager – ein Radialkugellager – das Gewicht der Schüssel, und am unteren Ende ermöglichte ein sphärisches Kugellager die präzise Bewegung der Spindel. Vollmilch wurde unter Druck durch die Spindel in den Boden der Schüssel geleitet. Die Dichtung zwischen dem stationären Einlassrohr und der rotierenden Spindel bestand aus einer U-förmigen, mit Gewebe verstärkten Gummidichtung. Die Milch gelangte über die zentrale Kammer am Boden in die Schüssel und wurde von dort wie üblich im Scheibenstapel verteilt.

Da sie kein Loch in der Mitte hatte, war ihr Durchmesser im Vergleich zu Maschinen mit Obertransport erheblich reduziert. Durch die Gesamtkonstruktion wurde der gesamte freie Raum in der Schüssel mit Flüssigkeit gefüllt.

Neben der Erreichung des Hauptziels – Rahm und Magermilch ohne Schaum – bot der hermetische Separator mehrere weitere Vorteile; Das wichtigste davon war seine Fähigkeit zur sauberen Abschäumung, die besser war als bei jedem anderen Separator. Zwei Faktoren trugen zu diesem verbesserten Leistungsniveau bei. Erstens wurde die Milch in der langen Hohlspindel sehr sanft beschleunigt, wodurch die Spaltung von Fettkügelchen minimiert wurde. Zweitens erhielten die Alfa-Scheiben einen kleineren Innenradius, wodurch die verfügbare Trennfläche bei gegebenem Trommelvolumen vergrößert wurde.

Das gleiche hermetische Hohlspindel-Design ist von zentraler Bedeutung für Culturefuge, die weltweit erste vollständig hermetische Zellkulturzentrifuge, die hauptsächlich für Anwendungen mit Säugetierzellkulturen und gefälltem Protein entwickelt wurde. Sein Einsatz sollte eine möglichst sanfte Beschleunigung in einem Zentrifugal-Scheibenstapelseparator ermöglichen, der speziell für die Ernte von Zellkulturen entwickelt wurde.

Durch die sanfte Beschleunigung werden die Zellen nur minimalen Scherbelastungen ausgesetzt. Ebenso wichtig ist, dass die Hohlspindel ein wirklich hermetisches Design schafft, das Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen innerhalb der Zentrifuge vollständig eliminiert und somit auch die Schaumbildung, eine Hauptursache für den Proteinabbau, verhindert.

Als Bonus ermöglicht das Design auch den Zentrataustrag mit kleinem Radius, was sowohl den Stromverbrauch senkt als auch den Temperaturanstieg während der Trennung auf ein Minimum beschränkt.

In einem mathematischen Modell für den Bruch scherempfindlicher Partikel in der Einzugszone in Zentrifugalabscheidern wurde festgestellt, dass der Bruch unabhängig von der Durchflussrate ist. Eine Studie von Boychyn et al. simulierte das Strömungsfeld in der Beschleunigungszone einer herkömmlichen Zentrifuge mithilfe von Computational Fluid Dynamics (CFD). In dieser Studie wurden zwei Fälle verglichen: ein klassischer Fall mit Luft in der Einzugszone und einer mit sanfter Flüssigkeitsfüllung, also ohne Luft.

Diese Modellierungstechnik bestätigte, dass bei der Beschleunigung mit vorhandener Luft die maximale Energiedissipationsrate bis zu doppelt so hoch ist wie bei der Beschleunigung ohne Luft.

Eine höhere Energiedissipation führt zu einem deutlich höheren Partikelbruch in der Protein-Präzipitat-Suspension und damit zu einem schlechteren Klärungserfolg. In einer späteren Studie von Boychyn wurde ein ähnliches CFD-Tool verwendet, um die Beschleunigungskräfte in der Beschleunigungszone einer Mehrkammerschüssel zu modellieren. In dieser Studie konnte die Gruppe genaue Vorhersagen zur Zentrifugenleistung treffen.

Schließlich gibt es eine vergleichende Studie derselben Forschungsgruppe über Zellkulturen, die in zwei kleinen Scheibenstapelzentrifugen im Produktions-/Pilotmaßstab verarbeitet wurden. Ein Separator verfügte über eine klassische, nicht gefüllte Beschleunigungszone und der andere über einen hermetischen Hohlspindeleinlass zur sanften Beschleunigung des Feeds. In allen anderen wichtigen Aspekten (äquivalente Fläche, Drehzahl usw.) waren die Maschinen identisch. Die Gruppe stellte fest, dass eine Hohlspindelzentrifuge im Vergleich zum anderen Separator eine 2,5-fache Steigerung des Durchsatzes bei gleicher Klärleistung ermöglichte.

Übertragen auf ein modernes Zellkultur-Erntesystem wie das Culturefuge ermöglichte diese Hohlspindeltechnologie die Bereitstellung einer Methode zur kontinuierlichen Zellernte unter hermetischen Bedingungen. Die auf einem Rahmen montierte Culturefuge besteht aus einem Hochgeschwindigkeitsabscheider mit Scheibenstapel und Rohrleitungen für Betriebsflüssigkeiten und Prozessflüssigkeiten. Es umfasst ein integriertes elektrisches System mit Anlasser, SPS-Steuerung und Pneumatikeinheit. Ein Motor mit integriertem VFD ist Standard. Optional kann das System auch eine dampfsterilisierbare Pumpe zum Transport der Feststoffphase enthalten. Das Design von Culturefuge entspricht den meisten wichtigen Druckbehälterspezifikationen, einschließlich ASME und PED.

Alle produktberührenden Teile sind aus hochwertigem Edelstahl gefertigt. Verschiedene Oberflächengüten sind erhältlich: 1,2 μm Ra, 0,8 μm Ra oder 0,5 μm Ra mit Elektropolitur. Das auf einem Rahmen montierte, modulare Design kann für den offenen Betrieb, den geschlossenen Betrieb, den dampfsterilisierbaren aseptischen Betrieb oder den reinen Dampfdekontaminationsbetrieb geliefert werden.

Das Zufuhrmaterial gelangt durch einen Hohlspindel-Zufuhreinlass in die Culturefuge 100 und beschleunigt sich allmählich, während es sich nach oben bewegt, wodurch die Scherkräfte auf die Flüssigkeiten minimiert und eine Zelllyse verhindert werden. Um die Gefahr einer Vermischung mit Luft zu vermeiden, ist die Einzugszone vollständig mit rotierender Flüssigkeit gefüllt. Durch die Bereitstellung dieses vollständig hermetischen Auslasses wird die Möglichkeit ausgeschlossen, dass Materialien mit der Luft oder der Außenumgebung in Kontakt kommen. Dadurch werden Schaumbildung und Denaturierung des Produkts vermieden.

Während der normalen Produktion hält das Betriebswasser den verschiebbaren Schüsselboden gegen die Schüsselhaube geschlossen. Während des Austrags senkt sich der Boden des Schiebebehälters für kurze Zeit (weniger als eine Sekunde) und die Feststoffe werden durch die Austragsöffnungen ausgeworfen. Im Zyklon wird die hohe Geschwindigkeit der ausgeschleuderten Feststoffe reduziert.

Die Ernte von Zellen zur Entwicklung neuer Impfstoffe und Medikamente ist aus dem Bereich der Science-Fiction in die Realität vorgedrungen, unter anderem dank eines Stücks Huhn und eines Separators, der ursprünglich Milch aus Sahne entrahmte und nun dabei hilft, das wertvollste Gut von allen zu gewinnen: gute Gesundheit .